MEM細胞培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)是實驗室里常見和基本的實驗了，但卻不是簡單的。別小看細胞培養(yǎng)，這里可蘊含著大學問。有時候細胞狀態(tài)不好，轉(zhuǎn)染 、藥篩這些實驗根本就沒辦法做。影響細胞培養(yǎng)的因素很多，讓我們先從培養(yǎng)基和血清說起。

經(jīng)典的培養(yǎng)基有很多種，Invitrogen (GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是應用廣泛的培養(yǎng)基。其他如M199、IMDM、L15培養(yǎng)基等也用于某些細胞的培養(yǎng)。

◆ MEM是由Eagle’s基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME)發(fā)展而來的，其中增加了組分的范圍及濃度。

◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM )培養(yǎng)基是為小鼠成纖維細胞設(shè)計的，現(xiàn)在常用于貼壁細胞的培養(yǎng)。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是MEM的4倍，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩沖作用。初的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L，后來為了某些細胞的生長需要，將葡萄糖含量又調(diào)整為4500 mg/L，這就是大家常說的低糖和高糖了。

◆ aMEM含有附加的氨基酸、維生素以及核苷和脂肪酸，它可廣泛應用于各種細胞類型，包括對營養(yǎng)成分要求苛刻的細胞。

◆ Ham’s F12是為在低血清濃度下克隆CHO細胞而設(shè)計的，現(xiàn)在也廣泛應用于克隆形成率的分析及原代培養(yǎng)。F12還可以與DMEM 等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結(jié)合的產(chǎn)物，這種培養(yǎng)基已應用于許多原代培養(yǎng)及更難養(yǎng)的細胞系的培養(yǎng)。

◆ RPMI 1640培養(yǎng)基是專為淋巴細胞培養(yǎng) 而設(shè)計的，現(xiàn)在已廣泛應用于懸浮細胞的培養(yǎng)。

以前經(jīng)常聽到有人問，這種細胞該用哪一種培養(yǎng)基呢?其實這個問題的答案可以很簡單，也可以好復雜。此話怎講?如果這種細胞是購自ATCC或其他的細胞庫，那很簡單，問供應商就行了。或者找到相關(guān)的文獻，作為參考。Invitrogen網(wǎng)站上有一個Cell Line Database的工具，也很好用。選擇你感興趣的細胞類型，它就會彈出推薦的培養(yǎng)基、血清和轉(zhuǎn)染試劑等，有時還有優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染步驟，很方便。Sigma網(wǎng)站上也有一個Media Expert，包括了培養(yǎng)基所有成分的功能描述、使用推介和參考文獻等，它還是一個解決問題能手，對于細胞培養(yǎng)中的常見問題，如細胞貼壁不好、培養(yǎng)基變色等，它都會列出可能的原因，并提供補救辦法。這個Expert果然不簡單!

但如果你是著手建立一種全新細胞的培養(yǎng)體系，根本找不到任何參考，那你就得花點時間自己試驗了。萬事開頭難嘛。因為沒有一個標準答案。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，MEM做貼壁細胞培養(yǎng)、RPMI 1640做懸浮細胞培養(yǎng)會是一個好的開始。你也可以購買幾種培養(yǎng)基來，然后花大約兩周的時間做一個簡單的細胞生長實驗，來選擇其中適合的。有時候你會驚訝地發(fā)現(xiàn)你的比較不錯的培養(yǎng)條件與文獻報道的不同，就算是同一種培養(yǎng)條件，細胞的生長狀態(tài)也時好時壞，這是很正常的。因為試劑、水、不同批號的血清之間都存在著差異。要提高培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，可以從培養(yǎng)基和血清兩方面入手。

以前大部分實驗室都是用干粉培養(yǎng)基，但配制過程就較為繁瑣，要溶解、調(diào)pH值，過濾，過程中可能會產(chǎn)生一些濃度誤差，而且有些實驗室的水質(zhì)并不理想，所以培養(yǎng)的效果會有差異。如果使用液體培養(yǎng)基，這種人為的誤差會減少，因為畢竟是大批量工業(yè)化生產(chǎn)的，批間差會很小。大家是不是感覺液體培養(yǎng)基會貴很多，以前是這樣，但現(xiàn)在非也。HyClone和Invitrogen都在國內(nèi)建立了液體培養(yǎng)基的生產(chǎn)基地，生產(chǎn)和運輸成本大幅降低，所以現(xiàn)在的價格也只是50-60元/500ml，比干粉培養(yǎng)基貴不了多少，而且還幫你省了過濾器和時間。

血清含有生長因子可促進細胞的繁殖，含有附著因子可促進細胞的貼壁，同時還具有抗胰酶活性。血清同時也是礦物質(zhì)、脂類及激素的來源。常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時間的早晚來分類的。采血時間越早，營養(yǎng)物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細胞系和克隆化培養(yǎng)。由于瘋牛病的原因，到目前為止，我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區(qū)進口牛血清，因此市面上的牛血清大多來自澳洲、南美洲，或是國產(chǎn)的。

而血清批次間的差別就是不可避免的，這種差異來源于不同的制備方法和除菌方法、動物的年齡差別及血清的儲存條件等，而且與取血動物的來源關(guān)系密切。不同的牧場、不同的氣候天氣及其他環(huán)境因素都可能影響血清的質(zhì)量。因此選好了一種血清就要盡可能長期使用它。在需要更換時，也要盡量保持與原有的一批血清相似?，F(xiàn)在很多公司都提供血清預留，你一旦選定了某個批次的血清，可以備足一年的量，這樣可以避免很多麻煩。

血清固然是細胞培養(yǎng)中*的成分，但正如上文所說，血清的批間差異大，更換血清時需要做大量的測試以取保替換的血清與原來的相似。而血清的供應也是必須要考慮的因素。由于氣候或瘋牛病的影響，說不定哪天血清就突然沒得賣了，那對實驗的影響可非同小可。另外，血清的價格也很昂貴，雖說現(xiàn)在也有便宜的國產(chǎn)血清，但是高品質(zhì)的澳洲血清價格仍舊高企。因此，也有一些實驗室開始換用無血清培養(yǎng)基。

無血清培養(yǎng)基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顧名思義，就是在細胞培養(yǎng)中不需要添加血清，但是在某些應用中可能要添加生長因子或細胞因子。無血清培養(yǎng)基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素等，能減少上述血清帶來的不利因素，使細胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。但它也不是沒有意思缺陷的的，從有血清培養(yǎng)過渡到無血清培養(yǎng)的條件并不像想象中那么直截了當。處于發(fā)育的不同分化階段的細胞(例如干細胞與定向前體細胞相比)需要不同的配方，對生長因子和細胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時，也去除了一些血清蛋白具有的保護、解毒作用，因此對試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。另外，它的價格也比普通的培養(yǎng)基貴很多。

現(xiàn)在有很多廠家生產(chǎn)無血清培養(yǎng)基。GIBCO這個細胞培養(yǎng)的金字招牌當然少不了，它也是早研制無血清培養(yǎng)基的。目前已經(jīng)開發(fā)了ES細胞、雜交瘤、CHO、293、昆蟲細胞、神經(jīng)細胞、淋巴細胞、角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞的無血清培養(yǎng)基。上個月還推出了間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，能使MSC維持未分化狀態(tài)超過9代。HyClone公司也有CHO、293、雜交瘤細胞、昆蟲細胞、病毒疫苗細胞的多種無血清培養(yǎng)基。Sigma則剛剛收購了澳大利亞JRH公司，有了JRH的EX-CELL系列，無血清培養(yǎng)基的選擇也更多了。

這么多種，要選擇起來也是個頭疼的事情。除了部分培養(yǎng)基是公開配方的，如用于培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的MCDB 131(Sigma)，大部分液體培養(yǎng)基都是配方的，也就是說其中的成分是保密的。那么你只能是檢索文獻、讓供應商推薦，然后用自己的細胞做幾次傳代培養(yǎng)來選出合適的培養(yǎng)基。畢竟實踐出真知嘛。

P.S.附上一些細胞培養(yǎng)中的小Tip，可能會對您有所啟發(fā)。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)

? 切記，細胞培養(yǎng)基的儲存條件是2-8攝氏度。如果細胞培養(yǎng)基不小心被凍，您應該融化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

? 貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。

? 當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

? 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

? 總之，大部分添加物和試劑多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

? 血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補體系統(tǒng)。在免疫學研究，培養(yǎng)ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往*的操作步驟，并沒有確鑿的證據(jù)說明這樣做是有益的。相反，對大部分細胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因為加熱可能使血清中的沉淀增加，使您誤以為污染。

? 如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?

1. 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。并隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

2. 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

3. 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

4. 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

? 在進行傳代培養(yǎng)時，我們強烈推薦進行臺盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳代，不進行活性檢測，您可能接種比你認為的低的多的濃度的細胞，這常?？赡軐е律L緩慢或培養(yǎng)物根本不生長。

? 貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。

? 在訂購的細胞到達后，應立即復蘇，如果培養(yǎng)基還沒有準備好，可將其放入液氮中，盡快復蘇。千萬不能放置在-20或-80℃的冰箱內(nèi)。

? 細胞復蘇往往是比較容易出問題的步驟。請在訂購細胞時就向供應商索取詳細的復蘇步驟，并仔細閱讀。有些供應商就不推薦在復蘇時離心，對此類細節(jié)，應特別留意。